Terapia génica para EBS y RDEB (2022)

A pesar de la dificultad para obtener muestras de piel durante el período de restricciones de Covid, los investigadores demostraron que su tratamiento podría permitir que el cambio genético que hace que RDEB se pierda ("omisión de exón") en la piel y en las células en un plato. Inyectar el tratamiento en muestras de piel sobrantes de procedimientos quirúrgicos resultó en un nivel bajo pero detectable de omisión de exón en el paso anterior a la producción de la proteína de colágeno. Los investigadores sugieren que se necesitaría más trabajo para demostrar si esto permitió producir suficiente proteína de colágeno para reducir los síntomas de RDEB.

El uso de pequeños fragmentos de ácido nucleico (como el ADN) para ayudar a producir colágeno y proteína de queratina a partir de genes RDEB o EBS dañados ha demostrado ser prometedor en las células. Ha sido más difícil demostrar los efectos en la piel, donde estos pequeños fragmentos de ácido nucleico terapéutico parecen funcionar de manera diferente. Los investigadores publicaron un artículo una estrategia SEO para aparecer en las búsquedas de Google. del progreso en esta área en 2021. 

Este proyecto se ha basado en el trabajo que los investigadores publicaron en 2019:

• La omisión natural de exones prepara el terreno para la omisión de exones como terapia para la epidermólisis ampollosa distrófica: terapia molecular – ácidos nucleicos (cell.com)
• Terapias para la epidermólisis ampollosa: el parto es clave – Bremer – 2019 – British Journal of Dermatology – Wiley Online Library

Universidad de Dundee reportaron sobre el proyecto en 2019.

Investigadores principales:

Dra. Robyn Hickerson es investigador principal en la Facultad de Ciencias de la Vida con un grupo de investigación activo cuyo objetivo principal es el desarrollo de terapias para trastornos genéticos raros de la piel.
Dr. Peter van den Akker, becario de investigación clínica DEBRA, es un genetista clínico experimentado y ha centrado su carrera de investigación en terapias basadas en ARN para RDEB y otras genodermatosis.

Co-investigador:

Dra. Aileen Sandilands Tiene una amplia experiencia de 19 años en el grupo en trastornos genéticos de la piel y en el desarrollo de sistemas de salto de exón con el objetivo de tratar trastornos genéticos de la piel.

“Nuestro objetivo final es desarrollar terapias para todas las formas de EB… Basándonos en los resultados emocionantes y alentadores de nuestro trabajo anterior, ahora planeamos optimizar la eficiencia de la omisión de exones en nuestros modelos de piel humana ex vivo e in vivo, para acercarnos a un ensayo clínico”

Dr. Robyn Hickerson y Dr. Peter Van den Akker

Título de la subvención: Desarrollo de nueva tecnología genética para el tratamiento de la epidermólisis ampollosa simple (EBS) y la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB)

Alrededor del 70 % de los casos de epidermólisis ampollosa (EB) se clasifican como EB simplex (EBS), que es causado por mutaciones (errores) en los genes que fabrican proteínas llamadas queratina 5 y queratina 14 (KRT5 y KRT14). Las queratinas son vitales para asegurar una piel fuerte y saludable. No existen tratamientos efectivos para EBS, que se caracteriza por ampollas persistentes y mala cicatrización de la piel tanto interna como externamente. Los genes se heredan, una copia de cada padre. Solo una copia del gen necesita contener una mutación para causar EBS; estos se denominan genes dominantes. Al suprimir selectivamente la expresión de la copia defectuosa del gen, esto permite que la copia normal del gen funcione correctamente, una estrategia que se cree que podría convertirse en una terapia adecuada para EBS.
El objetivo inicial de este proyecto era desarrollar una nueva tecnología para el silenciamiento génico terapéutico en EBS. Cuando se lee la secuencia genética o de ADN de un gen, similar a una receta, finalmente se traduce a través de una etapa intermedia (ARN mensajero) en la producción de proteínas, en este caso las queratinas que se encuentran en la capa superior de la piel, la epidermis. Los nuevos desarrollos en tecnología genética significan que ahora es posible sintetizar una pequeña porción de ácido nucleico que se unirá al ARN mensajero y lo inactivará. Esto se denomina tecnología de silenciamiento de genes. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) son pequeños fragmentos de ácido nucleico que pueden diseñarse para unirse específicamente a copias de ARN mensajero de un determinado gen para destruirlas.

El Clinical Research Fellow se encargó de desarrollar esta nueva tecnología de silenciamiento de genes hasta el punto en que pudiera llevarse a la clínica. El equipo en Dundee ha estado trabajando con la compañía farmacéutica Ciencias de la vida WAVE en este proyecto y han identificado varios ASO que pueden silenciar el ARN mensajero KRT14 en células de piel humana cultivadas en el laboratorio.

El uso de ASO para la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (una forma más grave de EB) es igualmente desafiante. La epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB, por sus siglas en inglés) es causada por fallas en el gen COL7A1, la receta genética para la proteína colágeno tipo 7. Todo el mundo porta dos copias de COL7A1, pero, a diferencia de EBS, debe haber una mutación en ambas copias del gen para exhibir los síntomas de RDEB: estos son genes recesivos. El enfoque para destruir el ARN mensajero defectuoso no funcionará aquí. Sin embargo, se puede usar una clase diferente de ASO que puede engañar a las células para que eliminen la parte del ARN mensajero donde se encuentra la mutación. Este enfoque se denomina 'omisión de exón' y, aunque conducirá a un ARN mensajero ligeramente más corto, aún puede usarse para producir colágeno tipo 7 activo (pero más corto). En un estudio de literatura, el becario descubrió que las personas en las que la omisión de exón se produce de forma natural (sin el uso de ASO, sino debido a una variación adicional del ADN) todavía tienen una forma de DEB, pero esto es más leve de lo habitual. Esto enfatiza que la omisión de exón es una estrategia terapéutica prometedora. El equipo de Dundee ha diseñado varios ASO que pueden inducir la omisión de exón de COL7A1 en células de piel humana cultivadas en el laboratorio.

Nueva tecnología antisentido para EB: optimización de la omisión de exón en la piel humana (Beca de investigación clínica, año 5).

Los pacientes con el trastorno genético de la piel epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB) sufren de una piel extremadamente frágil porque falta una proteína clave (colágeno 7) que mantiene unidas las capas de la piel. En pacientes con RDEB, los errores de ortografía ("mutaciones") en el gen que codifica la proteína colágeno 7 impiden que el cuerpo la produzca. En la Universidad de Dundee, estamos tratando de eludir los errores ortográficos en el gen del colágeno 7 al enfocarnos en el paso que ocurre antes de que se produzca la proteína. Antes de que se produzca la proteína de colágeno 7, el gen primero hace una copia portátil de sí mismo, esta copia se llama ARN mensajero y se usa como plantilla para hacer la proteína. En los pacientes con RDEB, la copia del ARN mensajero contiene los mismos errores ortográficos que el gen del colágeno 7. Nuestra estrategia es eliminar una pequeña parte del ARN mensajero que contiene los errores ortográficos. Este enfoque se conoce como "salto de exón". Aunque el ARN mensajero será un poco más corto de lo normal, aún se puede usar para producir la proteína colágeno 7. Por supuesto, esta proteína también será un poco más corta de lo normal, pero aún así es mejor que no tener ninguna proteína de colágeno 7.
La omisión de exón utiliza pequeñas moléculas llamadas oligonucleótidos antisentido (ASO) que se adhieren a la copia del ARN mensajero del gen del colágeno 7 y engañan a las células para que eliminen la parte donde se encuentran los errores ortográficos. Hemos diseñado varios ASO y demostrado que son activos en la omisión de exón cuando se agregan a células de piel humana cultivadas en el laboratorio. También hemos podido demostrar que los ASO son activos en piel humana real (piel de desecho quirúrgico). Sin embargo, la cantidad de omisión de exón que podemos detectar en la piel es baja y los ASO parecen funcionar de manera ligeramente diferente en la piel en comparación con las células cultivadas en el laboratorio.
Durante el último año hemos estado optimizando un método que nos permite rastrear la forma en que se distribuye un ASO cuando se inyecta en la piel humana. Este método nos enseñó que un ASO que se inyectó en la piel humana de hecho viajó desde la dermis (la capa profunda de la piel donde se inyectó el ASO) hasta las células de la epidermis (la capa superior de la piel), donde se salta el exón. necesita tener lugar. Este resultado nos convenció aún más de que el tratamiento con ASO puede inducir la omisión de exón en la piel humana real. Una vez más, este fue un resultado alentador. Sin embargo, la cantidad de omisión de exón que detectamos en la piel fue baja y los ASO parecen funcionar de manera ligeramente diferente en la piel en comparación con las células cultivadas en el laboratorio. Por lo tanto, ahora nos centramos en hacer que la omisión de exón en la piel sea más eficiente.
El año pasado también diseñamos y probamos 37 ASO nuevos contra el exón 13 en células de la piel para ver si podemos identificar un ASO que funcione incluso mejor que los que usamos actualmente. También hemos diseñado 33 ASO nuevos contra el exón 15 para probar de la misma manera. Los resultados preliminares han identificado varios ASO que muestran actividad de omisión del exón 13, por lo que se investigarán más a fondo. (Del informe de progreso de 2022).

Nueva tecnología antisentido para EB: avances en la omisión de exones en la piel humanaAños 3-4).

El objetivo principal ahora es estudiar si los ASO funcionales pueden inducir la omisión de exón del gen COL7A1 y el silenciamiento de la copia de ARN mutante de KRT14 cuando se aplican a la piel humana (utilizando piel sobrante de procedimientos quirúrgicos). Esto implica estudiar formas de entregar estos ASO en el lugar correcto de la piel. Por lo tanto, el becario está trabajando en estrecha colaboración con el equipo del Dr. Hickerson.
Los principales objetivos de la beca de investigación clínica en el futuro son:
• Inducir la "eliminación" del ARNm mutante de KRT14 para tratar la EBS (para trabajar en la eliminación del ARN mensajero de queratina que porta la mutación).
• Omitir exones que contienen mutaciones en el gen COL7A1 para tratar RDEB (para engañar a las células del cuerpo para que eliminen o no lean la parte del gen donde se encuentra la mutación).

Los pacientes con el trastorno genético de la piel epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB) sufren de una piel extremadamente frágil porque falta una proteína clave (colágeno 7) que mantiene unidas las capas de la piel. En pacientes con RDEB, los errores de ortografía ("mutaciones") en el gen que codifica la proteína colágeno 7 impiden que el cuerpo la produzca.

Durante este proyecto, hemos estado tratando de engañar a las células para que eviten los errores ortográficos en el gen del colágeno 7. Para hacer esto, nos enfocamos en un paso importante que ocurre antes de que se produzca una proteína. Un gen tiene que hacer una copia portátil de sí mismo primero, esta copia se llama ARN mensajero y las células la utilizan como plantilla para producir la proteína. En los pacientes con RDEB, la copia del ARN mensajero contiene los mismos errores ortográficos que el gen del colágeno 7. Nuestra estrategia es editar la pequeña parte del ARN mensajero que contiene el error ortográfico. Llamamos a este enfoque "salto de exón". Al editar el ARN mensajero de esta manera y eliminar el error de ortografía, las células ahora pueden producir la proteína colágeno 7. Por supuesto, esta proteína será un poco más corta de lo normal, pero aún así es mejor que no tener ninguna proteína de colágeno 7.

La omisión de exón utiliza moléculas diminutas llamadas oligonucleótidos antisentido (ASO), que se adhieren a la copia del ARN mensajero del gen del colágeno 7 y engañan a las células para que eliminen la parte que contiene el error ortográfico. Hemos diseñado varios ASO y hemos demostrado que son capaces de provocar la omisión de exón cuando tratamos células de piel humana cultivadas en el laboratorio. También hemos intentado tratar las células de la piel de un paciente con RDEB con nuestros ASO y parecen funcionar de la misma manera. También podemos detectar la proteína de colágeno 7 en estas células después de tratarlas con los ASO, lo que nos dice que los ASO funcionan según lo previsto.

Una parte significativa del proyecto se ha dedicado a averiguar si los ASO funcionan en la piel humana. Nuestro objetivo final es utilizar los ASO para tratar a los pacientes, por lo que es importante saber si están activos en la piel y no solo en las células de una placa. Antes de que pudiéramos comenzar este trabajo, tuvimos que desarrollar métodos de detección altamente sensibles para detectar la omisión de exón porque estas herramientas de investigación no existían comercialmente. Para los experimentos en la piel, inyectamos los ASO en restos de piel sana de procedimientos quirúrgicos y luego analizamos la piel en busca de saltos de exón. Descubrimos que los ASO pueden causar saltos de exón en la piel humana, lo que, por supuesto, es un resultado extremadamente alentador. Sin embargo, el mayor desafío al que nos enfrentamos es que la cantidad de omisión de exón que podemos detectar en la piel es baja. Los ASO también parecen funcionar de forma ligeramente diferente en la piel en comparación con las células cultivadas en el laboratorio. Es cierto que no sabemos si el nivel de omisión de exón que vemos en la piel es suficiente para beneficiar a los pacientes (solo un ensayo clínico proporcionaría una respuesta definitiva), pero creemos que aún hay margen de mejora. Por lo tanto, en la parte final del proyecto nos concentramos en formas de aumentar la cantidad de omisión de exón en la piel. Diseñamos un nuevo conjunto de ASO para tratar de identificar uno que funcione incluso mejor que los que usamos actualmente, y también intentamos mezclar los ASO con un reactivo diseñado para facilitar la absorción de los ASO en las células después de que se inyectan en la piel.

En general, este proyecto ha demostrado que es realmente posible utilizar ASO para inducir la omisión de exones en piel humana real. Será necesaria la optimización de los ASO y mejoras en la forma en que se administran a la piel para reforzar sus efectos. Si se pueden superar estos obstáculos, la omisión de exones como tratamiento para la EBDR sigue siendo una opción viable. (Del informe final de 2022).